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1.1.3. LES BIOPUCES

1.1.3.1. Les technologies utilisées

 L'hybridation : théorie

Le concept de biopuce ou puce à ADN date du début des années 1990. Il a été à cette époque décrit par quatre équipes différentes, en Grande-Bretagne, en Russie et aux États-Unis. Il repose sur une technologie pluridisciplinaire intégrant la micro-électronique, la chimie des acides nucléiques, l'analyse d'images et la bio-informatique. Le principe de fonctionnement de ces puces repose sur un fondement de la biologie moléculaire : le phénomène de l'hybridation, c'est-à-dire l'appariement par complémentarité des bases de deux séquences d'ADN. Par analogie, on peut comparer ce mécanisme à celui de la fermeture éclair... En effet, les brins extraits de la double hélice d'ADN ont la capacité de reformer spontanément cette double hélice dès qu'ils se retrouvent face au brin complémentaire ; les quatre molécules élémentaires de l'ADN ont la particularité de s'unir deux à deux : l'adénine avec la thymine, la cytosine avec la guanine.

Le phénomène de l'hybridation permet d'identifier une séquence de nucléotides, c'est-à-dire l'enchaînement des bases d'un fragment d'ADN en mettant ce dernier en présence d'autres brins d'ADN, dont la séquence est connue.

Par exemple, face à des brins d'ADN synthétique représentatifs d'une maladie, les brins extraits de l'ADN du patient vont hybrider si le malade est porteur de l'affection recherchée.

Source : Le Figaro, 13 novembre 1997.

Le problème est " d'offrir " aux brins d'ADN du patient la possibilité d'hybrider avec de nombreux brins d'ADN synthétiques représentant les différents gènes correspondant à une pathologie, sous leurs différentes formes.

 Le support

Les brins synthétiques utilisés, ceux dont on connaît la séquence, s'appellent des sondes. Les puces à ADN présentent, par rapport aux méthodes classiques d'hybridation un avantage majeur : grâce aux techniques de miniaturisation elles permettent l'hybridation simultanée d'un nombre de sondes considérables sur une surface totale utile inférieure à 1 cm2. Les supports sur lesquels sont fixées les sondes se présentent sous la forme de surfaces planes ou poreuses (percées de puits) composés de matériaux tels que :

le verre, matériau peu onéreux, inerte et mécaniquement stable. Il est notamment utilisé par l'entreprise américaine Affymetrix et le consortium Genosensor). La société américaine Protogene (Palo Alto, Californie) avec laquelle les chercheurs de l'équipe du Professeur Francis GALIBERT, du CNRS, ont passé des accords de partenariat utilise une ingénieuse technique : la petite plaque de verre, substrat de la puce, est recouverte d'une grille de Teflon (qui détermine des zones hydrophiles et hydrophobes).

les polymères sont à la base des techniques développées par l'équipe d'Andrei MIRZABEKOV (Argonne, Illinois) ainsi que par les chercheurs de la société CIS Bio-international qui utilisent plus précisément le polypyrrole ;

le silicium, couramment utilisé pour la fabrication des puces électroniques à cause de ses propriétés semi-conductrices (matériau choisi par plusieurs équipes et notamment par le laboratoire IFOS de l'École centrale de Lyon - UMR 5621 du CNRS).

- les métaux, notamment l'or et le platine (utilisés par la société américaine Nanogen et le Consortium Genosensor).

 La fixation des sondes

Quel que soit le support choisi, il est traité pour former un réseau dense et régulier de microsurfaces et sur chacune de celles-ci est greffée une sonde d'ADN synthétique. Il existe deux méthodes : le transfert de brins d'ADN ou sa synthèse in situ.

- La synthèse préalable à la fixation des sondes permet de fixer des sondes relativement longues, atteignant 40 à 60 bases. Le transfert de ces sondes sur la puce peut se faire au moyen de micropipettes, de micropointes ou par des dispositifs de type jet d'encre.

Un autre système, choisi par la société CIS Bio International en collaboration avec les chercheurs du CEA à Grenoble (LETI)15(*) est l'adressage électrochimique : la puce est composée d'un support en silicium recouvert, à chaque plot d'une mini-électrode en or. Chaque sonde rejoint un plot particulier lorsque les mini-électrodes sont mises sous tension sélective.

Les méthodes d'adressage des sondes sont fondamentales : leur performance, leur capacité à être automatisées et leur coût de fonctionnement pèseront lourd dans le développement de la technologie des puces à ADN.

La synthèse in situ : dans ce cas, la construction des sondes se fait par dépôt de couches successives des quatre bases de l'ADN sur un support en verre. C'est un masque, dont la configuration varie à chaque dépôt d'une couche, qui permet aux bases de s'empiler correctement. Avec ce procédé, utilisé par Affymetrix, les sondes comportent au maximum 30 bases.

Là encore, la société Protogene innove : elle a mis au point un système qui permet de déposer sur la grille de téflon de la biopuce, les quatre bases désirées, grâce à des injecteurs piézo-électriques, selon une technologie qui s'apparente à une synthèse d'ADN classique. C'est l'équivalent d'une imprimante à jet d'encre à quatre couleurs (chaque couleur étant en l'occurrence une base : A, G, T, C). Ce procédé est extrêmement flexible : il permet de fabriquer indifféremment telle ou telle sorte de biopuce, de même qu'une imprimante imprime indifféremment telle ou telle page, quels que soient les mots du texte.

 L'hybridation : réalisation pratique

Le rôle de chaque sonde est de reconnaître, dans un mélange appliqué à la surface de la biopuce, une séquence d'ADN. Généralement cette séquence est amplifiée par PCR16(*) puis marquée par fluorescence, préparée en solution et mise en contact avec la biopuce.

La phase d'hybridation est réalisée dans une sorte d'incubateur (station fluidique) et suivie d'un lavage destiné à débarrasser la puce des cibles nucléiques non hybridées.

 La détection des hybridations

Elle permet de déterminer à quelle sonde s'est appariée la séquence d'ADN analysée.

Le procédé Affymetrix repose sur l'utilisation d'un scanner qui permet de repérer les sondes d'ADN devenues fluorescentes, c'est-à-dire ayant donné lieu à une hybridation. D'autres procédés sont à l'étude chez Clinical Micro Sensors (Californie) ou à l'École centrale de Lyon et se fondent sur les modifications des charges électriques du support en silicium où sont fixées les sondes (système GenFet). La mesure de ces modifications permet de repérer les associations spécifiques entre les sondes et les oligonucléotides cibles.

1.1.3.2. Les possibilités d'utilisation



LES APPLICATIONS17(*)

Diagnostic

Pharmacie

Recherche

Agro-alimentaire

Environnement

Immuno-essais hormone & cancer

Criblage médicamenteux " screening "

Séquençage, analyse de séquences

Classification

Microbiologie

Microbiologie ADN antigènes/anticorps

Mise au point médicaments

Tri moléculaire

Contamination

Polluants

Facteurs aggravants cardio-vasculaire vieillissement

Pharmacogénomique

Vision intégrée des voies métaboliques

 

Plantes

Toxicologie

 
 

Aide au suivi des essais cliniques, adaptation de la thérapie

 
 
 

 Le séquençage par hybridation (SPH)

Alors que la méthode enzymatique dite méthode de Sanger peut être considérée comme une épellation de la séquence, c'est-à-dire une lecture base par base, le SPH procède par lecture de petits blocs. L'analyse porte sur des sous-séquences chevauchantes qui sont lues et réassemblées au moyen d'un programme informatique qui reconstitue la séquence étudiée.

Le séquençage par biopuces constitue une alternative intéressante et plus précise à la méthode classique du séquençage en terme d'automatisation et de réduction des coûts et des durées d'exécution. Cependant tous les problèmes techniques ne sont pas résolus.

 L'identification de cibles pour la recherche thérapeutique :

La contribution des biopuces au séquençage s'accompagne d'une aide à la compréhension plus fine du génome et de sa régulation. Ainsi, grâce aux puces à ADN, ont été mis en évidence de nouveaux gènes s'exprimant spécifiquement dans le tissu cérébral de l'enfant, ou apparaissant associés à des pathologies inflammatoires rhumatismales ou intestinales. Les biopuces devraient contribuer à l'identification de cibles thérapeutiques pour la recherche pharmaceutique. Elles serviront aussi à déterminer la résistance aux antibiotiques de certaines souches microbiennes pour permettre de mieux lutter contre celles-ci.

La pharmacogénomique :

La pharmacogénomique consiste à identifier les gènes impliqués dans l'efficacité (ou l'inefficacité) d'un produit, ou ses effets indésirables.

Elle conduit à une meilleure compréhension des mécanismes d'action des médicaments. En montrant qu'une molécule a sur une cible une action variable, la biopuce ouvre le champ des potentiels thérapeutiques. Elle permet aussi d'identifier les effets secondaires d'un produit et, lors des essais cliniques, de faire des mesures de toxicité.

 Le diagnostic des maladies infectieuses et génétiques

Ce thème est développé dans le chapitre 1.2.4.

D'un point de vue économique, il est important de noter que le marché mondial de diagnostic médical par biopuces sera en pleine expansion d'ici quelques années.

 En dehors du secteur médical, trois secteurs industriels non négligeables offrent des débouchés aux biopuces :

- L'agro-alimentaire : le suivi des bactéries productrices de ferments lactiques, détection des séquences provenant d'organismes génétiquement modifiés dans les semences.

- L'environnement : l'analyse bactérienne de l'eau de consommation, la détection des agents infectieux dans l'alimentation, l'air ou l'eau (Salmonella, Listeria, Legionnella).

- La guerre bactériologique ou chimique : en déterminant par avance les modifications du fonctionnement génétique des cellules immunitaires occasionnées par des agents toxiques, on peut identifier rapidement les produits chimiques (mercure, dioxine...) ou bactériologiques (bacille du charbon ou de la diphtérie...) disséminés par un éventuel agresseur.

Les multiples possibilités d'utilisation des biopuces expliquent que la concurrence règne entre les entreprises de biotechnologie qui souhaitent dominer un marché très rentable à moyen terme.

1.1.3.3. La production des biopuces



LES ACTEURS18(*)

 

SYNTENI

AFFYMETRIX

PROTOGENE

Méthode de fabrication

Dépôt de sondes PCR par robot à pointes

Synthèse in situ par photolithographie

Synthèse in situ par microfluidique

Nature des sondes

Sonde PCR : spécifique d'un gène

Sonde " oligonucléotide "

Sonde " oligonucléotide "

Densité

10 000 sondes/cm2

100 000 sondes/cm2

100-400 sondes/cm2

Coût

$ 4000/puce

Programme de R & D : 2,2 M$ (1 seul design $450/puce)

Prog. de R & D : 1,5 M$ (500 designs $300/puce)

Applications

Recherche Pharmacie

Recherche

Reséquençage Diagnostic

 
 

40 000 gènes analysés par puce

1700-7000 gènes analysés par puce

1 gène analysé par puce (BRCA1, P53, HIV)

 

Comme dans bien d'autres domaines biotechnologiques, les États-Unis sont en pointe pour les puces à ADN.

La société Affymetrix reste incontournable actuellement pour plusieurs raisons :

 Elle a mis au point la première puce à ADN et bénéficie d'une expérience technologique certaine ;

 Elle a protégé ses différentes techniques, -notamment de dépôt de sondes sur la puce et de séquençage par hybridation- par d'innombrables brevets. Ses concurrents devront donc inévitablement la combattre19(*), s'allier avec elle (c'est la stratégie de Bio-Mérieux) ou tenter de la contourner en utilisant des techniques différentes (c'est la solution adoptée par Protogene).

 Le fait que Glaxo-Welcome détienne 34 % du capital d'Affymetrix lui confère une réelle solidité économique.

 Elle commercialise aussi les scanners de lecture automatique des biopuces (près de 700 000 F le lecteur) à ceux qui achètent ses biopuces et constituent en quelque sorte une clientèle captive.

Les biopuces sont aussi produites par d'autres sociétés américaines, de moindre importance mais parfois associées à de grands groupes de pharmacie ou d'instruments scientifiques : Synteni (rachetée par Incyte Pharmaceuticals à la fin de 1997) Hyseq (associée à Perkin Elmer), Molecular Dynamics, Nanogen, ...

En Europe, quelques équipes développent le procédé des puces à ADN :

- l'Institut Engelhardt de Moscou travaille avec les groupes américains Motorola et Packard Instrument, ainsi qu'avec le Laboratoire national d'Argonne (Illinois).

- Le centre allemand de cancérologie de Heildelberg collabore avec l'Université danoise de Copenhague.

- En Angleterre vient de voir le jour la société Oxford Gene Technology, qui développe une technique particulière de fixation des fragments d'ADN sur les puces.

- En France, la société CIS-Bio-International (Saclay) étudie une technologie spécifique en collaboration avec le LETI (Laboratoire d'électronique, de technologie et d'instrumentation) et le DRFMC (département de recherche fondamentale de la matière condensée) du CEA (Commissariat à l'énergie atomique) à Grenoble.

Aujourd'hui, le LETI développe un nouveau programme : AMIGO, exposé dans la deuxième partie du présent rapport.

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