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1.1.4. LA CHIMIE COMBINATOIRE ET LE CRIBLAGE À HAUT DÉBIT

" L'apparition de nouvelles technologies a bouleversé la recherche de nouveaux médicaments dans sa phase initiale. Celle-ci inclut tout d'abord la synthèse et l'isolement de nouvelles molécules puis leur essai sur des systèmes biologiques permettant de présupposer d'un intérêt thérapeutique éventuel. Cette phase était classiquement longue et pénible. La synthèse chimique relevait d'un art difficile ; au départ, le choix d'une structure de base se faisait sans guide. Les essais sur les animaux entiers ou les organes isolés étaient longs et complexes. Au total, malgré des progrès au fil des années, le processus relevait plus de la " pêche à la ligne " que de la démarche rationnelle. Trois approches ont profondément transformé cette recherche.

1. Les techniques conformationnelles

La théorie des récepteurs postule que c'est l'union de la molécule de médicament avec une macromolécule (une protéine en général) qui est à l'origine de l'effet pharmacodynamique et plus généralement de la réponse thérapeutique. Cette union est fortement spécifique : seules quelques molécules privilégiées en sont capables. On dit que le médicament est comme " la clé dans la serrure ". On sait maintenant déterminer la conformation dans l'espace des protéines, notamment grâce à la radiocristallographie aux rayons X, donc celle des récepteurs. On peut donc prévoir quelles structures devront présenter les molécules pour pouvoir s'unir à eux. Cette recherche est aidée par les programmes informatiques qui permettent de visualiser les molécules et de les faire tourner dans l'espace (conception assistée par ordinateur).

Bien que hautement sophistiquée et évidemment plus ardue que ces quelques lignes pourraient le laisser croire, cette approche permet de ne plus s'en remettre au hasard dans la recherche des séries chimiques intéressantes. On voit, cependant, qu'il est indispensable de connaître au départ le récepteur pertinent, c'est-à-dire d'avoir une hypothèse physio-pathologique et d'avoir été capable d'identifier et d'isoler la protéine qui le porte. Là aussi, des progrès décisifs ont été faits dans l'isolement des protéines et, mieux -encore, dans le repérage et le clonage des gènes qui commandent leur synthèse.

2. La chimie combinatoire

Il est désormais possible de synthétiser en une seule opération plusieurs centaines de molécules c'est ce que l'on appelle la chimie combinatoire. On part de la structure de base déterminée a priori comme il vient d'être dit et on génère systématiquement toutes les variations possibles en greffant des radicaux chimiques, des chaînes latérales, en modifiant le squelette, etc. Ceci se fait non plus étape par étape, mais en mettant en présence les réactifs nécessaires. On obtient ainsi d'un seul coup plusieurs centaines de molécules. Toutes les opérations, synthèse, isolement et identification, sont miniaturisées et robotisées. Le gain de temps et l'abaissement des coûts sont considérables. On peut ainsi constituer une bibliothèque de plusieurs milliers de dérivés en quelques mois.

3. Le criblage à haut débit

Le problème est alors d'identifier parmi toutes ces molécules celles qui sont pourvues des propriétés biologiques les plus intéressantes. Le gain de temps et l'augmentation de la productivité apportés par la chimie combinatoire l'auraient été en vain si la productivité de cette phase de repérage appelée " criblage " n'avait pas été aussi améliorée. Aux essais longs et limités de la pharmacologie expérimentale classique, a succédé une technique qui permet d'essayer dans le minimum de temps des milliers de molécules.

Le test consiste à mette en présence la substance à tester et un système biochimique (une enzyme par exemple) et de mesurer l'importance de la réaction éventuelle. L'essai peut être fait simultanément avec un grand nombre de systèmes, de significations très diverses. En fait, tout est miniaturisé et robotisé. Les opérations se déroulent sans intervention humaine et les résultats sont lus sur l'imprimante.

Tout dépend de ce que l'on met dans les tubes et, une fois de plus, on ne trouvera que ce que l'on cherche. C'est dire l'importance des hypothèses physiopathologiques. Les systèmes biologiques testés ne sont pas indifférents : ce sont ceux dont on pense qu'ils interviennent de manière cruciale dans le déterminisme de la maladie. On voit donc bien que cette recherche appliquée, dont les progrès sont si remarquables, est totalement tributaire de la recherche fondamentale d'amont.

L'opération finale est celle du choix. La plupart du temps, toutes les molécules intéressantes ne peuvent pas passer en développement. Il faut donc sélectionner les plus prometteuses, compte tenu de leurs résultats aux tests, mais aussi d'autres considérations comme leur facilité de synthèse ou leur pharmacocinétique. Si les opérations répétitives ont été automatisées, l'inventivité de l'esprit humain intervient donc toujours dans les choix des hypothèses, des tests et in fine des molécules. "

(20(*))

1.1.4.1. Chimie combinatoire et constitution de chimiothèques

La chimie combinatoire

Le principe de la chimie combinatoire est d'accroître les chances de trouver une molécule active, un candidat-médicament, en multipliant le nombre de molécule étudiées21(*).

 La synthèse

C'est une sorte de jeu de construction qui permet de synthétiser de très nombreuses molécules par combinaison. Les chimistes, en cela, imitent la nature qui, à partir de quelques molécules élémentaires, a construit toute la variété des gènes et des protéines.

Au cours des années 1980, les immuno-chimistes cherchaient à établir la structure des fragments des protéines virales (peptides viraux) qui déclenchent les réactions du système immunitaire d'un organisme infecté par un virus. Pour synthétiser de nombreux peptides de 5 à 12 acides aminés, ils ont mis au point une méthode appelée synthèse en parallèle.

La synthèse en parallèle

Dans la synthèse en parallèle, une petite bille de polystyrène est fixée à une tige de polyéthylène ou " pin ". Chacun des puits de la plaque contient un seul acide aminé.

On plonge tous les pins dans les puits, et l'acide aminé présent dans chaque puits se greffe sur la bille immergée, par l'intermédiaire d'un " bras " (le cylindre). Puis on change les acides aminés contenus dans les puits, et les billes sont à nouveau immergées. Le nouvel acide aminé se lie au premier, formant un dipeptide. Après n étapes, on obtient un oligopeptide qui est libéré dans le puits après rupture du bras qui le reliait à la bille de polystyrène.

Par cette méthode, on obtient autant de peptides différents qu'il y a de puits, et ces molécules sont formées par la succession des acides aminés qui ont été successivement introduits dans les puits.

(22(*))

La méthode combinatoire est dérivée de cette synthèse mais elle est beaucoup plus puissante car elle produit un nombre de molécules croissant exponentiellement à chaque étape de la synthèse. Il s'agit alors d'une synthèse dite divergente ou dissociée.

LES DIFFÉRENTES MÉTHODES DE SYNTHÈSE DES BANQUES COMBINATOIRES

La synthèse en parallèle divergente

La synthèse par répartition et mélange





Étape 1

On dispose d'un jeu de trois molécules A1, A2, A3. Ces molécules sont fixées sur des billes de polystyrène différentes.

Étape 2

On ajoute dans chacun des puits le mélange des trois molécules A1, A2, A3. On obtient les molécules A1A1, A1A2, A1A3 ; A2A1, A2A2, A2A3 ; A3A1, A3A2, A3A3 (pour simplifier, on n'a représenté qu'un type de molécules par puits, mais, en réalité, les trois types de molécules sont mélangés, sur chaque ligne).

Étapes suivantes

Au bout de deux étapes, on a synthétisé 32, soit neuf molécules différentes (en recommençant n fois la même opération, on obtient 3n molécules). Toutefois, les billes portent toutes un mélange de molécules, ce qui rend l'identification de la molécule active difficile.





MOLÉCULES

A1A1 A1A2 A1A3

A2A1 A2A2 A2A3

A3A1 A3A2 A3A3

Étape 1

Des billes de polystyrène sont introduites dans les tubes à essai. Les molécules A1 sont placées dans le premier tube, les molécules A2 dans le deuxième, etc. On n'a représenté que trois tubes, mais on peut en utiliser des dizaines.

Étape 2

Le contenu des tubes est filtré et rincé, et toutes les billes sont regroupées et mélangées.

Étape 3

Le mélange est partagé en trois, et des molécules A1, sont introduites dans le tube 1, des molécules A2 dans le tube 2, etc.

Étapes suivantes

On recommence les opérations de mélange et de partage autant de fois qu'il est nécessaire pour ajouter toutes les sous-unités voulues. Une bille ne porte qu'un seul type de molécules, car, à chaque étape, les billes ne sont en contact qu'avec un seul réactif. Un test colorimétrique identifie la bille qui porte la molécule active.

(23(*))

Ce type de synthèse a été rendu possible par le fait que B. MERRIFIELD24(*) a réussi à développer des peptides sur de petites billes de polymère chimiquement inertes.

La chimie combinatoire utilise ces billes de polymère de la façon suivante : placées dans un solvant, les billes gonflent, de sorte que l'intérieur devient accessible aux réactifs dissous dans ce solvant. Chaque bille porte environ 1013 amorces qui se combinent avec les réactifs. Par réactions successives on obtient des oligomères, des molécules constituées d'un enchaînement de plusieurs sous-unités.

 Le marquage des molécules

La seconde étape consiste à " étiqueter " les molécules au fur et à mesure de leur élaboration, de façon à pouvoir identifier chacune d'elles à la fin du processus. Plusieurs techniques sont utilisées :

- La première est l'ajout, à chaque stade de la synthèse, d'un composé inerte sur un site distinct de la bille ; cela crée une sorte de signature chimique de la molécule ;

- La seconde est l'ajout, à chaque stade également, d'une base (A, T, G ou C) qui permettra ultérieurement de reconnaître la molécule en lisant la séquence après amplification par PCR (polymerase chain reaction) ;

- La société française CEREP utilise des codes barres pour assurer la traçabilité des produits. " Chaque opération, chaque produit est référencé. L'ordinateur lit les codes et permet au chimiste d'accéder directement aux informations qu'il recherche ou au robot de savoir quels échantillons il traite ".25(*)

- La société californienne Irori a lancé, en juin 1996, le système Accutag : il s'agit de développer des molécules sur des billes contenues dans une capsule où se trouve également un microprocesseur. La paroi de chaque capsule est comme un filet qui laisse passer les réactifs chimiques nécessaires à la synthèse, mais retient les billes de polymère.

À chaque étape de la synthèse, un signal radio est envoyé à chaque microprocesseur afin d'enregistrer en détail la réaction à laquelle la bille est exposée. Ces données peuvent ensuite être lues sur les microprocesseurs lorsque les molécules en sont arrivées à leur stade final.

Toutefois, le système électronique utilisé reste trop volumineux pour permettre de produire des centaines de milliers de composés.

C'est pourquoi, Irori a signé des accords avec Rhône-Poulenc Rorer et Bristol-Myers Squibb pour mettre au point un nouveau procédé qui devrait, à terme, permettre de synthétiser près de 25 000 composés par semaine. L'idée est d'utiliser des étiquettes code à barres à deux dimensions et à lecture optique au lieu du système des étiquettes à radiofréquence c'est-à-dire des " volumineux " microprocesseurs contenus dans la capsule.

Les nouvelles molécules créées par la chimie combinatoire sont rassemblées dans de vastes chimiothèques. Les chimiothèques " généralistes " fournissent une grande diversité de structures moléculaires. Toutefois, ces molécules sont d'un intérêt inégal et il est indispensable de les trier pour déterminer les plus actives et quel type de cible elles peuvent atteindre.

UNE NOUVELLE FAÇON DE CRÉER DES MOLÉCULES INÉDITES :

LES MOLÉCULES DARWINIENNES

" Faisant appel aux principes de la sélection naturelle, un logiciel engendre des molécules-modèles inédites, futures candidates au statut de médicament.

Plusieurs modèles chimiques permettent déjà de trouver informatiquement de nouvelles molécules actives. Le dernier logiciel en date propose d'appliquer la sélection naturelle darwinienne sur des modèles de molécules. Les résultats de David NOEVER lui ont valu le titre d'innovator de l'année 1998, décerné par le magazine américain Discover. Grâce à cette idée, David NOEVER a fondé une start-up qui travaille notamment avec le National Cancer Institute (NCI) et une dizaine d'entreprises privées. Son logiciel part d'une molécule fournie par un laboratoire, connue pour son action sur certaines maladies. Il en construit ensuite jusqu'à trente " parents ", des molécules élaborées automatiquement selon des critères géométriques, physico-chimiques ou autres.

A chaque molécule est associé un " Chromosome " fictif représentant ses caractéristiques. L'algorithme déclenche alors un processus de reproduction sur cette population de chromosomes, en autorisant les mutations (changement ponctuel et aléatoire) et les cross-over (échange d'une séquence entre deux chromosomes). À chaque génération, le logiciel choisit les meilleurs reproducteurs, par exemple les molécules ayant la configuration de plus basse énergie. En calculant quelques milliers de générations, on voit apparaître de nouvelles molécules, parmi lesquelles seules les meilleures " survivent ". David NOEVER précise que, " lors des expériences réalisées pour le National Cancer Institute, les experts du NCI ont toujours vérifié que les molécules proposées n'avaient jamais été observées auparavant ". En jouant sur les paramètres de sélection, NOEVER peut aussi modéliser la fixation de ligands sur une protéine, ou encore prédire la forme exacte d'une molécule d'après sa formule chimique, en un temps record: quelques minutes sur une station de travail. "

La Recherche. N° 313. Octobre 1998.

1.1.4.2. Le criblage à haut débit

Les laboratoires pharmaceutiques ont tout intérêt à restreindre leur champ d'investigation expérimentale en le ciblant correctement pour aboutir à de nouveaux médicaments le plus vite possible à un moindre coût. C'est pourquoi ils passent au crible les nouvelles molécules ; ce criblage doit être réalisé à haut débit.

 Le criblage virtuel

Cette technique relativement récente est notamment mise en oeuvre par la société Syntem. L'ordinateur aide le biochimiste à faire le tri parmi les molécules. " Par une évaluation rationnelle de l'activité biologique des molécules, on peut diminuer le nombre de molécules à synthétiser en laboratoire d'un facteur mille ou plus "26(*). Puis les nouvelles molécules sont modélisées : leurs propriétés globales (exemple : affinité pour les graisses, solubilité...) sont analysées et ces descriptions sont communiquées à l'ordinateur qui réalise un premier tri, permettant de sélectionner les molécules qui, compte tenu de ces propriétés, ont le plus de chance d'être actives en fonction de telle ou telle cible.

 Le criblage biologique

C'est actuellement le procédé le plus utilisé. Il consiste à identifier les molécules actives par mise en contact avec la cible biologique. Ces cibles peuvent par exemple être des protéines dont on a identifié expérimentalement l'implication dans tel ou tel processus pathologique.

Jusqu'au début des années 1990, les essais traditionnels en éprouvette permettaient à une personne de tester 2000 composés par an. L'emploi de microplaques à 96 puits a ensuite permis de réaliser 6 000 essais par jour et par robot sur une même cible. Aujourd'hui les microplaques comportent 384 puits, certaines pouvant aller jusqu'à 1 536 puits. Ces progrès ont permis de multiplier les tests et, également, de réduire les coûts car les essais sont " miniaturisés " et utilisent des volumes d'échantillons très réduits.

Le criblage à haut débit se caractérise par l'utilisation de robots capables de gérer simultanément de grands nombres de microplaques, facilement manipulables et stockables, où sont effectués des milliers de tests par jour.

Le criblage à haut débit est issu des progrès de la robotique. Il repose sur des systèmes capables de réaliser des taches séquentielles indépendantes telles que dilution, pipettage et répartition de composés dans des cupules ou puits, agitation, incubation, lecture de résultats. Ils sont pilotés par des logiciels spécifiquement adaptés au type d'analyse à réaliser. Les essais sont effectués dans des microplaques standards identifiées par un code à barres et manipulées par la " main " d'un robot : celle-ci prend la plaque vide, ajoute les réactifs nécessaires et les composés à tester, gère le temps de la réaction puis passe la plaque à un lecteur pour connaître le résultat. Pour visualiser les réactions issues de la mise en contact, dans les puits, de la molécule et de la cible, on utilise des méthodes basées sur la radioactivité ou, bien souvent, la fluorescence. Ces résultats sont stockés et analysés grâce à des ordinateurs.

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