B. PROGRAMME DE RECHERCHE DE L'ÉQUIPE DU MÉDECIN EN CHEF LATAILLADE À L'HÔPITAL MILITAIRE PERCY
SYNTHESE THEMATIQUE DES RECHERCHES
(Hôpital Militaire Percy - Centre de Transfusion Sanguine des Armées)
A. Intérêt des Cellules Souches Mésenchymateuses en Médecine Régénérative
Les Cellules Souches Mésenchymateuses (CSM) ont été initialement identifiées au sein de la moelle osseuse; elles ont également été isolées dans de très nombreux autres tissus (cartilage, thymus, rate, tissu adipeux...) et plus récemment dans le sang placentaire. La dénomination de CSM recouvre à elle seule les principales propriétés de ce type cellulaire d'origine mésodermique: autorenouvellement, capacité proliférative importante et multipotence. Il est en effet possible de les amplifier en nombre de façon très importante dans des conditions de culture standards (expansion in vitro ), et leur capacité à se différencier en divers autres types cellulaires d'origine mésodermique (chondrocytes, ostéoblastes et adipocytes...) mais également endodermique ou ectodermique (concept récent de plasticité cellulaire), a été bien définie pour des milieux de cultures spécifiques.
Les CSM sont caractérisées in vitro comme des cellules adhérentes d'aspect fibroblastique. Leur profil antigénique est bien précisé par l'expression de molécules de membrane telles que le CD105 (SH2), le CD73 (SH3, SH4), le CD90 (Thy1). Ce sont des cellules constitutives du microenvironnement médullaire soutenant fonctionnellement l'hématopoïèse, au-delà de leur rôle proprement structural, par le biais d'une production variée de cytokines et de facteurs de croissance. Ce rôle trophique des CSM existe en réalité au niveau de très nombreux tissus où elles participent au rôle de soutien du microenvironnement spécifique et inductif de chacun d'entre eux.
Des essais cliniques de phase I et II ont démontré l'innocuité de l'administration systémique de CSM amplifiées ex vivo et ont permis d'appréhender le bénéfice potentiel de leur utilisation dans des domaines aussi différents que celui de la médecine réparatrice et des pathologies malignes. Récemment la mise en évidence d'anomalies chromosomiques après culture a ralenti l'enthousiasme porté sur leur utilisation chez l'homme.
La traumatologie de guerre subit les évolutions technologiques des armes qui deviennent à la fois plus précises mais aussi plus délabrantes. Les réparations post-lésionnelles, qu'elles concernent les membres ou bien les organes vitaux (foie, muscles, système nerveux central), peuvent d'ores et déjà pour certaines d'entre elles et dans un avenir proche pour d'autres, bénéficier de nouvelles stratégies thérapeutiques faisant appel à la bio-ingénierie cellulaire et tissulaire. C'est dans ce contexte que nos travaux de recherche ont trouvé pour principales applications cliniques la réparation des pertes de substance osseuse et des brûlures cutanées. Dans ce dernier domaine, l'opportunité récente nous a été donnée de prendre en charge des victimes d'accidents d'irradiation présentant des syndromes cutanés aigus d'irradiation. L'approche de thérapie cellulaire développée pour ces patients pourrait être, dans un second temps, mise à profit pour d'autres types de brûlures. Ces activités de thérapies cellulaires ont pu être mises en oeuvre grâce à des travaux antérieurs qui ont permis de définir des protocoles de production de CSM de grade thérapeutique.
1/ Production de CSM de grade clinique
La réglementation française actuelle dans le domaine de la thérapie cellulaire autorise des procédés de production de cellules qui utilisent de préférence des milieux exempts de quelconque protéine d'origine animale. Dans cet objectif, nous avons mis au point un milieu de culture enrichi en facteurs de croissance humains d'origine plaquettaire. Ces facteurs de croissance sont obtenus à partir d'un lysat de plaquettes humaines qui est particulièrement bien adapté à la culture des cellules fibroblastiques et donc des CSM. En effet, les plaquettes produisent et stockent un grand nombre de facteurs de croissance comme le TGF-â, le bFGF (basic Fibroblast Growth Factor), l'IGF-1 (Insulin-like Growth Factor-1), les PDGF (Platelet-Derived Growth Factors), le VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) pour ne citer que les principaux. Par cryolyse (4 heures minimum à -20°C) d'un nombre standardisé de plaquettes, nous obtenons un sécrétât cellulaire enrichi en facteurs de croissance et en microparticules plaquettaires. L'adition de ce sécrétât dans un milieu de culture à la concentration de 5 à 8% permet de cultiver des CSM et d'obtenir des taux d'expansion cellulaire significativement supérieurs à ceux obtenus avec les conditions standards de culture (10% de Sérum de Veau Foetal (SVF) et 1 ng/mL de bFGF) et d'arriver à la confluence cellulaire en deux semaines au lieu de trois (en primoculture). Ces résultats sont très importants sur un plan thérapeutique si on se place dans une situation où on souhaite, en urgence, obtenir au plus vite un grand nombre de CSM à administrer à un patient.
Récemment, nous avons utilisé ce milieu de culture pour produire des cellules de grade clinique dans le cadre de traitements compassionnels de brûlures cutanées radio-induites. Pour cela le protocole de production de Lysat Plaquettaire a été optimisé pour obtenir un niveau de sécurité sanitaire compatible avec une utilisation injectable.
Un certain nombre de contrôles de qualité sont réalisés en cours et en fin de procédé de production cellulaire. Ils ont, pour certains d'entre eux, un rôle majeur pour la libération finale du produit cellulaire. Parmi ces critères libératoires, citons la stérilité du produit, la viabilité cellulaire et l'absence d'anomalies caryotypiques. En effet il est apparu récemment que les CSM présentaient une certaine instabilité chromosomique et pouvaient acquérir, au cours de la culture, des anomalies caryotypiques. Ces anomalies semblent apparaître de manière totalement aléatoire et semblent dépendantes des conditions de culture. En effet, elles surviennent moins fréquemment quand les cellules sont cultivées dans un milieu de culture enrichi en LP par rapport à des cultures en SVF. Il semble également qu'en fonction de leur origine, les CSM aient une instabilité chromosomique variable : les CSM issues de sang placentaire et de graisse seraient plus stables que celles issues de la moelle osseuse.
2/ Thérapie cellulaire des grandes pertes de substance osseuse
Dans la grande majorité des fractures osseuses, le déficit osseux se répare spontanément. Le processus biologique sous-jacent est considéré comme optimal et l'intervention humaine se limite à stabiliser mécaniquement la lésion. Cependant, dans 5 à 10 % des cas, on observe un retard ou une absence de consolidation. Cette absence de consolidation correspond souvent à la formation d'un mélange de fibrose et de tissus osseux et ne permet pas la restauration de la continuité osseuse. De plus, il existe des indications thérapeutiques spécifiques pour lesquelles il est nécessaire de réséquer des segments osseux de taille importante, par exemple dans certaines pathologies traumatiques de guerre associant délabrement osseux et infection (pieds de mine). La reconstruction d'un os fonctionnel dans ces grandes pertes de substance osseuse reste un problème. La structure simple du tissu osseux, son aptitude naturelle à régénérer et la possibilité d'amplifier aisément des cellules d'origine médullaire ayant un potentiel de différenciation osseuse font du tissu osseux un candidat de choix pour la thérapie cellulaire. Dans le passé, des résultats intéressants ont pu être obtenus par injection extemporanée de moelle osseuse dans les foyers de fracture qui n'ont pas consolidé spontanément. Cependant la moelle osseuse contient peu de progéniteurs ostéoblastiques et le volume de la suspension cellulaire à infuser constitue une limite de cette approche. Compte tenu des insuffisances des techniques actuellement disponibles nous avons évalué une nouvelle approche combinant la thérapie cellulaire à partir de CSM, l'apport de biomatériaux ostéogéniques et de colle biologique d'origine plaquettaire source de protéines adhésives et de biomolécules ostéoinductrices. Il s'agit d'une approche innovante dans la mesure où les thérapies cellulaires rapportées dans la littérature utilisent soit des CSM seules, soit associées à des biomatériaux mais sans colle biologique enrichie en facteurs de croissance.
Ce projet de recherche initié en 2002 se place dans la continuité d'un projet de recherche clinique réalisé en 2000 à l'Hôpital d'Instruction des Armées Percy et qui a montré la faisabilité et l'efficacité clinique de l'autogreffe de cellules mononucléées d'origine médullaire dans les foyers de pseudarthroses (fractures non consolidées mimant une néo-articulation). Nous avons souhaité aller plus loin dans cette approche de thérapie cellulaire autologue, à la fois sur le plan mécanistique in vitro mais également sur le plan physiologique par la mise au point d'un modèle de fracture expérimentale chez l'animal.
L'utilisation de cellules souches à potentiel ostéogénique présentes dans la moelle osseuse en combinaison avec des biomatériaux et de la colle biologique plaquettaire permet une meilleure biodisponibilité in situ des cellules impliquées dans la reconstruction osseuse et un apport local de facteurs de croissance. Il s'agit à notre connaissance du premier travail expérimental avec modèle animal qui évalue la triple association CSM/biomatériau/colle biologique dans la réparation osseuse.
Ce projet regroupant biotechnologies transfusionnelles, cellulaires et substituts osseux couvre à la fois des aspects expérimentaux fondamentaux mais également une application au modèle animal qui est un pré-requis indispensable à une application clinique chez l'homme.
Il s'agit d'un travail collaboratif qui regroupe des compétences multiples au sein du Service de Santé des Armées :
- le Centre de Transfusion Sanguine des Armées pour la préparation des produits dérivés du sang (Plasma Riche en Plaquettes et colle biologique plaquettaire) et pour son savoir-faire en matière d'ingénierie cellulaire de grade thérapeutique,
- l'IMASSA (Institut de Médecine Aérospatiale du Service de Santé des Armées) par son expertise exploratoire en physiologie osseuse in vitro (département de physiologie intégrée) et sa primaterie équipée d'un bloc opératoire.
- le service de Chirurgie Orthopédique de l'Hôpital Percy pour son expérience dans la chirurgie orthopédique de « guerre ».
Enfin, nous venons de mettre en place l'organisation d'un consortium européen centré sur l'utilisation de biomatériaux cellularisés en médecine réparatrice pour répondre à un appel à projet de la Commission Européenne dans le cadre du 7 ième PCRDT (Programme Cadre pour la Recherche Développement et la Technologie). Nous avons réuni 15 laboratoires partenaires européens spécialisés dans le domaine de la réparation osseuse et travaillons sur l'élaboration d'un projet de recherche associant expérimentations pré-cliniques et essais cliniques chez l'homme.
3/ Thérapie cellulaire des brûlures cutanées radio-induites
La fréquence des accidents d'irradiation aiguë à de fortes doses, a augmenté ces dernières années [Georgie (1998), Turquie (1999), Pérou (2000), Panama (2001), Pologne (2001), Georgie (2002), Chili (2005), Sénégal (2007), France (2006-2007), Tunisie (2008)], en raison notamment de la mauvaise utilisation de sources radioactives dans le milieu industriel et médical. Si le phénomène est généralement limité quant au nombre de personnes atteintes, il n'en est pas moins catastrophique sur le plan humain et particulièrement lourd sur le plan de la prise en charge.
La pathogenèse des irradiations aiguës localisées est assez bien décrite dans la littérature mais la réponse médicale faite à ce type de pathologie reste encore une tâche extrêmement complexe et délicate. Le retour d'expérience des cliniciens en charge de la gestion médicale de ces patients (Centre de Traitement des Brûlés de l'HIA Percy) met en avant la nécessité de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. La Thérapie Cellulaire pourrait amener dans ce domaine un progrès significatif.
Une des caractéristiques de la réponse cutanée aux irradiations localisées à forte dose est le développement d'une nécrose tissulaire apparaissant après une phase cliniquement silencieuse et évoluant par poussées successives difficilement prévisibles. Cette nécrose est à relier à un processus inflammatoire local intense et caractérisé par sa récurrence. L'évolution redoutée des lésions de radionécrose, sous tendue par l'expérience rapportées dans la littérature, et par les données très précises de dosimétrie dont on peut disposer aujourd'hui, permet d'envisager la mise en oeuvre d'une nouvelle thérapie combinant les mesures conservatoires symptomatiques déjà mises en oeuvre à une thérapie cellulaire locale par cellules souches mésenchymateuses.
Les CSM trouvent leur place dans cette thérapie non pas du fait de leur propriété de multipotence mais plutôt du fait de leur rôle trophique. En effet, elles produisent certaines cytokines et facteurs de croissance qui auraient un rôle bénéfique dans le contrôle des manifestations inflammatoires locales qui caractérisent la brûlure radiologique. Ainsi le potentiel thérapeutique des CSM a été étudié dans le domaine de la radiopathologie par des équipes du Centre de Recherche du SSA (CRSSA) et de l'Institut de Radioprotection et de Sûreté Nucléaire (IRSN) sur des modèles animaux. Ces deux dernières années, trois patients ont pu bénéficier de cette thérapie cellulaire en association avec un traitement chirurgical d'exérèse et d'autogreffe d'épiderme. Pour chacun d'eux, il s'agissait de brûlures radio-induites sévères et très localisées (mains, bras, fesse) avec un risque important d'évolution vers une chirurgie radicale d'amputation. Les CSM ont été obtenues à partir de prélèvements de moelle osseuse autologue après une expansion in vitro de 15 à 17 jours. Les cultures ont été réalisées en milieu additionné de 8% de Lysat Plaquettaire de grade Clinique (LPC). Les contrôles de qualité réalisés, en particuliers les caryotypes, ont été tous normaux autorisant l'administration des cellules produites. 150 à 180.10 6 de cellules par injection ont été administrées localement au niveau des lésions après exérèse chirurgicale des tissus nécrosés en complément d'une autogreffe d'épiderme. En fonction de la gravité et de la rapidité d'évolution de chaque patient, 2 à 5 administrations ont été réalisées au total. Un effet spectaculaire sur la douleur a été constaté chez tous les patients dès le lendemain des administrations de cellules. Cet effet antalgique était fugace et disparaissait en quelques jours incitant à la réalisation d'injections supplémentaires. Un effet sur la rapidité et la qualité de la prise de greffe épidermique est également apparu significatif aux chirurgiens. Aucune récidive de nécrose n'est survenue chez ces patients après un recul de deux ans et demi pour le premier d'entre eux. Nous pensons que les CSM ont participé au contrôle local de l'inflammation, permettant une meilleure prise de greffe et une meilleure cicatrisation globale des lésions.
Un projet de recherche multicentrique visant à démontrer chez l'animal le mécanisme d'action des CSM dans la réparation de ces lésions radio-induites est planifié pour 2009.
B. Projets en perspective
La perspective de nouveaux projets mérite d'être soulignée, soit parce qu'il s'agit de projets faisant suite à des projets en cours, soit parce qu'il s'agit de thématiques nouvelles nées sous l'impulsion de l'actualité bibliographique ou de nouvelles hypothèses scientifiques.
1/ Projet de Recherche et Développement dans le domaine de la thérapie cellulaire des grands brûlés
Les risques d'exposition à des chimiques et à des radioéléments, ainsi que le risque terroriste, doivent être considérés aussi bien à un niveau civil que militaire. Les brûlures cutanées sévères qui peuvent en résulter nécessitent une prise en charge spécialisée qui peut être assurée à l'HIA Percy. Cependant, une limitation est que la structure n'est à ce jour pas autonome pour générer les greffons de peau qui peuvent être nécessaires. Ceux-ci sont actuellement produits aux Etats-Unis (Epicel ® , Genzyme Tissue Repair), à partir de biopsies prélevées chez le brûlé au niveau de zones saines. Les kératinocytes sont alors extraits, puis amplifiés en culture, selon la technique de Green, de manière à générer une surface de greffons suffisante pour permettre la couverture cutanée nécessaire. L'important coût inhérent à cette logistique représente à ce jour, un facteur limitant la mise en oeuvre de ces traitements. Par ailleurs, il faut préciser que cette technique est difficile d'emploi car les épithéliums produits sont fragiles et particulièrement sensibles à tous les traumatismes mécaniques ou infectieux. Les résultats obtenus sont spectaculaires en terme de survie mais restent frustrants par la qualité des cicatrices obtenues. Bien qu'il existe en Europe quelques tentatives de production d'épiderme cultivé, aucune ne semble, à ce jour, être capable de fournir des greffons d'aussi bonne qualité que ceux produits par Genzyme. On peut affirmer aujourd'hui que la clé d'une bonne prise de greffe repose sur la qualité de la culture et en particulier sa richesse en kératinocytes souches.
La Société l'Oréal produit des peaux équivalentes qui sont utilisées pour tester leurs produits cosmétiques avant leur mise sur le marché. Afin de faire bénéficier les grands brûlés de leurs avancées technologiques, l'Oréal et le Service de Santé des Armées se sont rapprochés sous la forme d'une coopération scientifique et technique qui permettra de mettre en place des essais cliniques de greffe de kératinocytes cultivés au sein d'un laboratoire de culture spécialisé. Ainsi est né le projet d'élaboration d'une « Unité de Thérapie Cellulaire Cutanée » (UT2C) localisée dans l'îlot Percy à Clamart.
Une collaboration scientifique avec le Laboratoire de Génomique et de Radiobiologie de la Kératinopoïèse (LGRK) du CEA a également été initiée et nous permettra d'acquérir des connaissances et un savoir faire de pointe dans le domaine de la kératinopoïèse.
2/ CSM de sang placentaire
Disposer d'une quantité importante de CSM en urgence serait d'un grand intérêt à la fois dans des situations cliniques où les CSM pourraient être administrées dès l'admission du patient (exemple de la victime d'un accident d'irradiation aigue) ou bien pourraient servir de stroma nourricier à la mise en culture de kératinocytes chez un grand brûlé sans attendre l'obtention de CSM autologues. La mise en place croissante de banques de sang placentaire pourrait répondre à cette attente. Les CSM issues de sang placentaire ont les mêmes caractéristiques que celles issues de tissus adultes (moelle, tissus adipeux) mais seraient plus immatures sur le plan immunologique. L'isolement des CSM de sang placentaire n'est pas aussi simple que celui de cellules issues de moelle osseuse ; Cela serait en partie du au fait de leur statut circulant. Dans le cadre d'un projet financé par l'Agence Nationale de la Recherche (ANR) en collaboration avec l'unité INSERM 602 dirigée par le Dr Georges UZAN, le Laboratoire de thérapie cellulaire de l'hôpital Saint Louis et une industrie spécialisée dans les dispositifs médicaux, nous travaillons sur la mise au point d'un protocole d'isolement des CSM de sang placentaire en vue de leur expansion en culture à visée thérapeutique. Les cellules ainsi produites seront caractérisées sur le plan fonctionnel en particulier vis-à-vis de leur utilisation dans les applications cliniques qui nous intéressent à savoir la réparation cutanée des brûlures, la réparation osseuse et le support nourricier des kératinocytes.
Médecin en Chef LATAILLADE