Né le 1er août 1782 à Aix-en-Provence, Eugène de Mazenod est le fils aîné de Charle-Antoine de Mazenod, un aristocrate ruiné, et de Marie-Rose Joannis, issue d'une riche famille bourgeoise. L'atmosphère familiale est perturbée par l'inégalité des deux époux sur le plan financier et par les interventions dans le ménage de la branche maternelle (tante et grand-mère).

En 1790, la famille s'exile en Italie. Pendant onze ans, elle vit entre Nice, Turin, Venise, Naples et Palerme. A Venise, Eugène de Mazenod fait une rencontre déterminante en la personne du Frère Bartolo Zinelli. La Révolution terminée, sa mère rentre en France alors que son père reste en Italie jusqu'en 1802. Malgré ses tentatives de réconciliation, il ne peut empêcher le divorce de ses parents. Ceci lui vaut de devenir le saint patron des familles en difficulté.

Pendant quelques temps, il hésite encore entre la vie religieuse et la vie dorée qu'il a par exemple connu à Palerme. En 1805, il commence à enseigner le catéchisme et à s'occuper de prisonniers. En 1807, un expérience mystique l'oriente vers le séminaire de Saint Sulpice (Paris) où il entre en 1808. Il est ordonné en 1811 à Amiens. Il renonce alors aux avantages que pouvait lui offrir sa naissance, préférant la charge de simple prêtre à Aix-en-Provence.

En collaboration avec son oncle, Fortuné de Mazenod, évêque de Marseille, il entreprend de raviver localement la foi et de redonner une discipline au clergé. Il prêche en provençal, essayant ainsi d'attirer vers l'Eglise des populations plus pauvres. Il s'occupe également des prisonniers et des malades, contractant le typhus, dont il finira par mourir.

Eugène de Mazenod rassemble autour de lui d'autres hommes d'Eglise pour former les Missionnaires de Provence. Après l'approbation de Léon XII en 1826 cette formation devient la congrégation des Oblats de Marie Immaculée. Elle est à l'initiative de la création de nombreuses paroisses ainsi que de la construction et de la restauration d'églises.

Après avoir été vicaire général de Marseille, Eugène de Mazenod est nommé évêque d'Icosie par Grégoire XVI, en 1832. La nomination, sans autorisation du gouvernement, de cet évêque légitimiste et ultramontain provoque une crise entre le pouvoir de Louis-Philippe et les autorités ecclésiastiques. Eugène de Mazenod séjourne à Tunis le temps que le conflit s'apaise. Ayant prêté serment au roi, il est finalement nommé évêque de Marseille en 1837, en remplacement de son oncle.

Il continue néanmoins à s'opposer au gouvernement dans le souci de briser le monopole de l'Etat sur l'éducation. A cet effet, il publie une Réclamation adressée au roi, à son Conseil et aux Chambres législatives à propos de la loi sur l'instruction secondaire. En 1850, il est un partisan convaincu de la loi Falloux. Sur le plan plus strictement religieux, il plaide pour la reconnaissance du dogme de l'Immaculée Conception. 

En 1851, Eugène de Mazenod soutient le coup d'Etat de Louis-Napoléon Bonaparte. La même année, il est nommé archevêque de Marseille. En 1856, son soutien au régime lui vaut d'être nommé sénateur (24 juin 1856) et de recevoir la légion d'honneur. Il obtient également de Napoléon III la construction d'une nouvelle cathédrale pour la ville de Marseille. Il plaide aussi pour la protection du pouvoir temporelle du pape.

Il meurt le 21 mai 1861 à Marseille. En 1975, il est béatifié par Paul VI. Il est canonisé par Jean-Paul II en 1995.